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涨姿势啦!感受态细胞转化效率高,原来都这样做啊!
点击次数:206      发布时间:2018-12-18

从事多年的研发实验,平时常常听到客户这样问,为什么我也是用的这个感受态细胞,但转化效率没那么高?今天上海淳麦生物科研者为大家进行详细讲解,教你如何提高感受态细胞转化率。

 

涨姿势啦!感受态细胞转化效率高,原来都这样做啊!

感受态转化效率定义

涨姿势啦!感受态细胞转化效率高,原来都这样做啊!

 

转化效率定义为转化1μl质粒至给定体积的感受态细胞中所能产生的菌落形成单位(cfu)的数量。但是,转化1μl质粒是不常见的。

 

实际上,转化效率常以在适条件下转化100pg—1ng高纯度超螺旋质粒来计算。

 

计算转化效率(TE)的公式为:

TE=菌落数/μg/稀释度。

 

转化效率计算可以用来做比较细胞或连接效率。下面列出了推荐转化方法和一些技巧以帮助获得实验结果。

 

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推荐方案

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一、转化方法

  1. 冰上解冻细胞

  2. 细胞中加入10ng—100ng的质粒DNA(1-5μl),混匀,切忌涡旋

  3. 置于冰上30分钟

  4. 42热激60秒或根据推荐条件进行热激

  5. 置于冰上5分钟

  6. 加入900μl室温的SOC

  7. 37震荡(250rpm)培养60分钟

  8. 混匀细胞,切忌涡旋,并用SOC做10倍梯度稀释

  9. 每个稀释比例取50-100μl稀释液涂布于预热的选择平板上,37(SHuffle菌株30)过夜培养或按推荐条件培养

     

 

二、5分钟转化方法

(与上述方法相比只有10%的转化效率)

 

  1. 手握解冻细胞

  2. 细胞加入10ng—100ng的质粒DNA(1-5μl),混匀,切忌涡旋

  3. 置于冰上2分钟

  4. 42热激30秒或按推荐方案进行热激

  5. 置于冰上2分钟

  6. 加入900μl室温的SOC或LB。快速取50-100μl涂布于选择平板上,37过夜培养(SHuffle菌株30)

    注意:使用非氨苄青霉素时,需要37震荡培养

     

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转化技巧

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01、解冻

  • 细胞在冰上解冻

  • 管中的后一点感受态融化后,立即加入DNA

  • 可以手握解冻细胞,但是一旦温度高于0时,转化效率就会下降

  • 细胞与DNA冰浴

  • 冰浴30分钟。预计每缩短10分钟会降低转化效率2倍

     

 

02、热激

  • 温度和时间取决于转化体积和适用的容器,一般为42孵育60秒

     

 

03、生长

  • 37生长1小时对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有效果。预计每缩短15分钟会有2倍的转化效率损失

  • SOC比LB培养基的转化效率高2倍

  • 震荡或旋转晃动试管可使转化效率提高2倍

     

 

04、涂平板

  • 选择转化效率不受温度、湿度明显影响的平板

  • 温暖而干燥的平板利于涂布,并能快速长出菌落

     

 

05、DNA

  • 用于转化的DNA应纯化,并重悬于水中或TE缓冲液中

  • 直接从连接产物中取10μl的DNA用于转化,仅有2倍效率损失

  • 为实现转化,可通过柱离心或酚抽提和乙醇沉淀的方法纯化DNA

  • 适DNA用量比通常认为的要低,纯化超螺旋pUC19的用量在100pg-1ng之间时转化效率高。但是,随着DNA用量增加至100ng,单次转化反应中得到的总克隆数也会增多

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