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【专题】分子克隆实验专题--(五)感受态细胞的选择与使用
点击次数:202      发布时间:2019-04-17

分子克隆实验专题--(五)感受态细胞的选择与使用
常用感受态细胞的特性:
TOP10,DH5α:蓝白斑筛选,高效克隆,质粒抽提
JM110:甲基化酶缺陷型
SURE:克隆不稳定插入片段,降低同源重组
DH10B:文库构建,长片段质粒的克隆(150kp
      质粒转化)
Stbl2:克隆不稳定插入片段,正向重复,逆转录病毒序列,克隆甲基化基因组序列。
Stbl3:克隆慢病毒表达载体中的正向重复序列,降低逆转录病毒载体中长末端重复序列的非目标同源重组。

        选择适宜的感受态细胞
       序列的结构,长度,载体种类以及特殊要求等。
        选择适宜的转化方式
       热激转化:常规克隆,片段较短(<10kb)
       电转化: 建库,基因敲除,长片段(>10kb)

感受态细胞使用的注意事项

        连接产物或质粒的量
      效价:1μg标准质粒转化感受态细胞产生的单克隆的数目,单位为cfu。
      化学感受态细胞:106,107,108,109cfu
      电转感受态细胞:108,109,1010cfu
      常规的克隆根据连接产物和质粒的量选择适当效价的感受态细胞,特殊转化(如建库)则选择感受态细胞,一般选用电转。

        感受态细胞效价测定
      标准质粒:pUC18, pUC19,pBR322
                        超螺旋,超纯
      质粒使用量:<5μl, <1ng
      设立阴性对照,多涂几板(3块以上)取平均值。
        化学感受态细胞的使用
       质粒PCR扩环的产物以及进行体内重组的线性片段不宜选用DH5α高效感受态细胞进行转化。
       可能原因: DH5α本身不适合这种操作;高效感受态制备的试剂对于这种转化有抑制作用。
        可选用TOP10感受态细胞。
        电转感受态细胞的使用
      尽量降低转化产物的离子浓度,防止细胞被击穿。
      大量的连接产物提纯后进行转化,或者进行透析后再转化,有些进行体内重组的酶切产物进行提纯后进行转化。
        氨苄平板的卫星菌落
       氨苄平板涂板后如果时间太长,就会产生卫星菌落,在单克隆周围生成小的克隆。
       氨苄抗生素只能抑制菌落生长,而不能杀死,当抗生素降解失效后,被抑制的菌体重新形成菌斑。
        解决方法:使用新鲜配置的氨苄培养基平板,提高氨苄的使用量,选用高质量的氨苄抗生素。

        感受态细胞的取用
       特殊制备的感受态细胞在超低温条件下可以维持效价半年以上,在制成之后要立即放入超低温冰箱。
       感受态细胞对温度的变化非常敏感,取用时要快取快放,不能将整包的细胞放在外面然后取用。
       看清标记,防止拿错。

 

上海淳麦生物科技有限公司  感受态细胞专家  4006815880

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